肥胖症的流行增加了人们对阐明短链脂肪酸对代谢、肥胖和大脑影响的兴趣。我们研究了丙酸（PA）和己酸（CA）对肥胖发展过程中Ldlr−/−.Leiden小鼠的代谢风险因素、肝脏和脂肪组织病理、大脑功能、结构（通过磁共振成像）以及基因表达的影响。Ldlr−/−.Leiden小鼠接受了16周的高脂饮食（HFD）以诱导肥胖，或以普通饲料作为对照组。随后，肥胖的HFD喂养小鼠接受了12周的以下处理：（a）HFD+CA（CA组），（b）HFD+PA（PA组），或（c）HFD对照组。PA降低了体重和收缩压，降低了空腹胰岛素水平，并减轻了HFD诱导的肝脏大泡性脂肪变性、肥大、炎症和胶原含量。PA增加了大脑中葡萄糖转运蛋白1阳性脑血管的数量，逆转了大脑血管反应性，以及HFD诱导的视神经、体感皮层和视觉皮层的微观结构灰质和白质完整性的影响。PA和CA还逆转了HFD诱导的视觉皮层和听觉皮层之间的功能连接影响。然而，PA处理的小鼠在旷场实验中表现出更多的焦虑，并且海马体中突触发生和谷氨酸调节因子的活性降低。

一、引言

肥胖的患病率在过去几十年中在全球范围内显著增加。肥胖与异位脂肪堆积、血脂异常、高胰岛素血症相关，并且会促进非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的发展。NAFLD涵盖了一系列肝病，从简单的脂肪肝到更严重的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。NASH的特征是脂肪肝和小叶炎症，并且可能会发展为肝纤维化。除了通过改变生活方式因素，例如通过饮食建议和体力活动减轻体重外，目前尚无获批的NASH药物疗法。此外，肥胖还与外周代谢器官的功能障碍、线粒体功能障碍以及大脑结构和认知功能障碍相关。在众多研究中报告了肥胖相关白质的变化，并且对脑血管也有影响，即脑血管反应性降低以及葡萄糖转运蛋白1（GLUT-1）表达减少，这是血管内皮细胞和血管健康的一个标志。

短链脂肪酸（SCFAs）已经显示出对肥胖发展的一些有益效果。例如，己酸（CA）被认为可能具有抗脂肪生成的效果。此外，一项小规模临床研究表明，结肠中丙酸（PA）水平的升高与体重增长减少以及肝脏脂肪减少相关。在啮齿动物研究中，PA已被证明可以防止饮食诱导的肥胖。此外，在用果聚糖治疗的肥胖小鼠中，PA水平升高与内脏脂肪减少和脂肪性肝炎减少相关。

在此，我们研究了CA和PA是否能够减轻高脂饮食（HFD）诱导的肥胖以及相关的NASH、肝纤维化和大脑功能障碍。为此，我们使用了低密度脂蛋白受体敲除（Ldlr−/−）Leiden小鼠，这些小鼠在HFD下约30周内会出现血脂异常、高胰岛素血症、肥胖、NASH、肝纤维化和高血压以及大脑功能障碍。PA和CA作为饮食补充剂在治疗环境中给药，即在建立肥胖后16周开始给药。

二、材料与方法

2.1 小鼠、饮食和研究设计

这是一项随机且对研究者和结果评估者双盲（盲于研究者和结果评估者）的对照研究。雄性Ldlr−/−.Leiden小鼠从荷兰TNO代谢健康研究的特定病原体自由繁殖种群中获得，并在荷兰Radboudumc Nijmegen动物研究设施的临床前成像中心（PRIME）饲养。小鼠以2-3只一组的方式饲养在数字通风笼中，通过笼子底部的12个电极可以全天24小时追踪小鼠的运动活动。小鼠饲养在传统动物室（相对湿度50%-60%，温度21°C，光照周期7 AM-7 PM），自由获取食物和水。所有动物实验均按照国际欧洲伦理标准（欧洲指令2010/63/EU）进行，并获得了TNO动物福利机构（许可证编号：TNO-345）和Radboud大学医学中心的批准。所有适用的（国）际和机构关于动物护理和使用的指南均被遵循，并按照ARRIVE指南在此报告。

本实验的研究设计如图1A所示。从3周龄断奶开始，所有组均接受标准饲料饮食（9.0% kcal脂肪，58.0%碳水化合物，33.0% kcal蛋白质)。15周龄时，小鼠被分为4个实验组（每组N=15），这些小鼠在治疗前根据体重进行了匹配。第1组的小鼠继续接受饲料饮食，而第2-4组的小鼠则转为接受含有茴香的高脂饮食（HFD）（45.0% kcal脂肪，35.0%碳水化合物，20.0% kcal蛋白质）。从31周龄开始直到研究结束（总共12周），第3组HFD饮食中补充了2.5% w/w CA（CA小鼠），第4组补充了2.5% w/w PA（PA小鼠）。

每周监测笼子级别的食物摄入量和个体体重。在治疗前和治疗后8周收集血液样本。在治疗前以及治疗后9-10周，通过旷场实验评估行为，并通过旋转杆实验评估运动技能。在治疗11周后，使用磁共振成像（MRI）测量大脑功能和结构。12周后，通过颈椎脱位后斩首的方式处死小鼠。由于健康问题（打斗导致），一只HFD小鼠在研究早期被处死，因此被排除在所有分析之外。

2.2 血浆测量

通过尾静脉采血，在禁食5小时后收集血液样本，以测定全血葡萄糖，并分离出EDTA血浆，其中总胆固醇、甘油三酯、血清淀粉样蛋白A（SAA）和胰岛素的测定方法如之前所述。

2.3 收缩压

使用计算机化和加热的尾袖容积描记仪（IITC Life Scientific Instruments）。进行一次试验，包括10次测量，以使小鼠适应限制器并使动物适应整个程序。然后在连续两天的两次试验中总共测量20次SBP，并以毫米汞柱（mm Hg）为单位表示平均SBP。

图1. 研究设计和体重。A，研究设计。从15至30周龄，Ldlr−/−小鼠接受饲料饮食或HFD饮食。31周龄时开始CA和PA治疗。测量收缩压，并收集血浆样本（见滴状物）。评估行为和认知，并进行MRI实验。在第43周，所有小鼠均通过颈椎脱位后斩首的方式处死。B，体重。31周龄时开始HFD补充CA或PA。参考小鼠继续接受饲料。HFD：高脂饮食；PA：丙酸；CA：己酸；OFT：旷场实验；MWM：Morris水迷宫。数据以均值±标准误表示。*P<.05；*P<.001。每组N=14（HFD）或N=15（饲料，CA，PA）只小鼠

2.4 肝脏组织学和生化分析

分离并称重肝脏。通过一位获得认证的病理学家使用经过良好建立的啮齿动物NASH评分方法（改编自人类NAFLD活动评分（NAS））在3μm肝脏苏木精-伊红（HE）染色切片中分析NAFLD的发展情况。

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简而言之，每只小鼠肝脏切片中受影响的总脂肪肝或肝细胞肥大（异常增大的肝细胞）程度以百分比表示。通过在每只小鼠的100倍放大下计数五个视野中的炎症聚集数量（视野面积4.15 mm²）并以每mm²的聚集数量表示来量化肝脏炎症。

将左叶迅速在液氮中冷冻并储存在-80°C下以进行生化分析。使用羟脯氨酸测定试剂盒和蛋白测定试剂盒（Quickzyme）按照制造商的说明测定肝脏总胶原含量和蛋白含量。使用比色法测定试剂盒测定肝脏酮体β-羟基丁酸，并使用含有蛋白酶抑制剂（100 mg/mL）的测定缓冲液按照制造商的协议使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒定蛋白含量。

按照Bligh和Dyer的方法在100 mg/mL磷酸盐缓冲液匀浆中测定肝脏脂质，然后在硅胶板上通过高效薄层色谱分离。随后，如之前所述对脂质进行染色，并使用ChemiDoc Touch成像系统进行分析。使用Image-lab 5.2.1软件（定量测定肝脏甘油三酯（TG）、胆固醇酯（CE）和游离胆固醇（FC）含量，并以每毫克肝脏蛋白表示。在相同的肝脏匀浆中，按照制造商的协议使用MAK016糖原测定试剂盒测定糖原含量。

2.5 白色脂肪组织（WAT）分析

分离并称重附睾（gWAT）、肠系膜（mWAT）和皮下（sWAT）白色脂肪组织库，并将5μm石蜡包埋切片用苏木精-磷苯-姜黄染色并进行数字扫描（Aperio AT2，Leica Biosystems，Amsterdam，the Netherlands）。使用Adiposoft分析脂肪细胞大小，Adiposoft是Fiji的开源自动化插件，用于图像处理软件包ImageJ。通过计数与脂肪细胞大小分析相同的视野中的冠状结构数量（CLS；脂肪组织炎症的组织学标志）并以每1000个脂肪细胞的CLS数量表示来量化炎症。

2.6 数字通风笼（DVC）

在实验期间，将小鼠饲养在DVC笼中（每笼2-3只小鼠），以研究全天24小时的运动活动。如之前所述，通过笼子底部的12个电极监测活动。对于处理结果的分析，我们使用了干预开始前2天和2夜以及实验结束时2天和2夜的活动数据。活动测量结果经过每笼小鼠数量的校正。

2.7 旋转杆

为了研究感觉-运动整合，将小鼠放置在旋转杆上（直径3.18 cm；IITC Inc，Woodland Hills，CA，USA），并记录它们留在装置上的能力作为跌落潜伏期。首先，通过将小鼠放置在静止的杆上1分钟，然后进行10 rpm的测试试验，使小鼠适应任务。接下来，进行四次加速试验，间隔30分钟（4至40 rpm），最大持续时间为300秒。

2.8 旷场实验

在旷场实验中评估探索行为和运动。将小鼠单独放置在一个方形旷场（45 cm×45 cm×30 cm）中，该旷场的墙壁由透明有机玻璃制成，并记录10分钟。运动和探索行为通过EthoVision XT10.1自动计算。

2.9 Morris水迷宫

使用Morris水迷宫（MWM）来检验长期记忆和空间学习能力。在习得阶段，小鼠被训练在充满水（21-22°C）的圆形水池（直径108 cm）中找到平台，水通过添加奶粉变得不透明。平台（直径8 cm）被淹没在水面下1 cm处，并位于水池的东北象限。小鼠每天进行4次习得试验，从四个不同的位置（南、北、东、西；最大游泳时间120秒；在平台上停留30秒；试验间隔60分钟）连续进行四天。在水池周围的四壁上距离0.5 m处有视觉线索。所有试验均被记录，找到平台的潜伏期（秒）被用作空间学习的衡量标准。小鼠在习得阶段的第四天结束时进行一次探测试验，此时平台从水池中移除。在探测试验中，小鼠被允许自由游泳120秒。试验被记录并通过EthoVision XT 10.1进行分析。

2.10 使用MRI的功能和结构大脑实验

所有MRI测量均使用11.7-T BioSpec Avance III小型动物MR系统进行。使用异氟醚进行麻醉（诱导时3.5%，维持时约1.7%）在1:2的氧气和空气混合物中。成像参数可在表S1中找到。

使用已建立的流动敏感交替反转恢复（FAIR）技术的动脉自旋标记（ASL）来指示脑血流（CBF）水平。

为了诱导血管收缩，将正常的1:2氧气-空气混合物改为3:0氧气和空气混合物。将两种条件下的CBF值用于评估脑血管从正常状态适应到血管收缩状态的能力，这被称为脑血管反应性。脑血管反应性通过从正常CBF值中减去血管收缩CBF值，然后除以正常和血管收缩CBF值之和来计算。为了计算区域CBF，我们使用了之前描述的相同协议。在全脑、皮层、丘脑（一个重要的大脑结构，用于将运动信号传递到皮层）和海马（一个重要的大脑结构，用于记忆巩固）中测量了CBF。

为了研究大脑中的白质和灰质完整性，使用了扩散张量成像（DTI）。分数各向异性是白质髓鞘化程度和纤维密度的标志，而平均扩散率是膜密度的逆度量。这些标量在几个手动选择的白质和灰质区域中测量：穹窿和胼胝体，以及左右半球的区域：听觉皮层、海马、运动皮层、视神经、体感皮层、视觉皮层、尾状核、前联合、杏仁核、外囊、海马旁回、小脑脚、内囊。

使用静息态功能磁共振成像（rs-fMRI）采集来评估支持多种认知和运动过程的特定感兴趣区域（ROI）之间的功能连接：背侧海马、腹侧海马、听觉皮层、运动皮层、体感皮层和视觉皮层。使用总相关和部分相关分析从血氧水平依赖（BOLD）时间序列中计算ROI之间的功能连接，如之前所述。部分相关强调了两个ROI之间的直接连接，同时它从所有其他ROI中回归了时间BOLD信号。

2.11 脑组织中酶促线粒体活性分析

使用玻璃-玻璃均质管在SEF缓冲液（0.25 M蔗糖，2 mM K-EDTA，10 mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4）中制备冻存小脑的均质液，以获得5% w/v的均质液。将均质样品在2°C下以600 g离心10分钟，然后将上清液进行三次冻融循环，以充分使线粒体通透化。使用KoneLab 20XT分析仪（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）通过之前描述的方法光谱光度法测定呼吸链的各个复合体（复合体I、II、III和IV）、柠檬酸合酶（CS）和琥珀酸细胞色素C氧化还原酶（SCC）的酶活性。将酶活性标准化为CS活性（线粒体数量的标志）。

2.12 定量实时聚合酶链反应

使用定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）分析冻存海马中的mRNA水平，如之前所述。使用甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和β2-微球蛋白（B2M）作为参考基因。使用StepOne软件版本2.2.2确定阈值循环（CT）值。将CT值标准化为两个参考基因的平均值，并使用Pfaffl方法转换为比较CT值。

2.13 使用NanoString神经炎症小组进行基因表达分析

使用NanoDrop 1000光谱光度法测量之前用于qRT-PCR的分离海马RNA的浓度。使用2100 Bioanalyzer评估分离RNA的质量。nCounter神经炎症小组（XT-CSO-MNROI1-12）编码集包含770个基因和13个内部参考基因用于标准化。使用25ng/ul样本的分离RNA制备报告代码集主混合物，并按照制造商的协议，将饲料、HFD和PA的样本在65°C下孵育24小时进行杂交。

将杂交样本加载到nCounter卡盒上，并在nCounter SPRINT上运行以测量条形码信号。使用nSolver 4.0分析内部参考基因的几何平均值用于计算参考标准化因子。内部参考基因计数低于背景水平或超出0.10-10.0范围标准化因子的被排除在外。在此，内部参考Asb10平均计数低于背景水平，Xpnpep1受我们的治疗影响，两者都必须从分析中排除。使用标准化的基因表达数据进行基因富集分析，以分析通路和生物过程，使用Ingenuity Pathway Analysis套件。使用IPA的上游调节因子分析工具评估上游调节因子的活性，如之前所述。

简而言之，分析了上游调节因子的所有已知目标基因的基因表达水平。

Z分数小于-2表示转录活性显著降低，而Z分数大于2表示根据目标基因的表达变化方向，在转化研究中报告的基于目标基因表达变化方向的显著激活。

2.14 脑组织的免疫组化

将左脑半球在4°C下浸泡固定过夜，固定在0.1 M PBS中的4%甲醛中，然后在0.1 M PBS中加入0.01%叠氮钠储存于4°C。在-60°C下切取冠状冰冻脑切片，切成8系列30-μm厚的切片，用于二氨基联苯胺-镍（DAB-Ni）免疫组化（IHC）染色。使用标准自由漂浮标记程序进行IHC，使用其他研究中描述的协议。

使用多克隆山羊抗双皮质素（1:8000；sc-8066 Santa Cruz Biotechnology Inc，Santa Cruz，CA，USA）对脑切片进行双皮质素（DCX）染色，作为未成熟神经元（神经发生）的标志。使用葡萄糖转运蛋白1（GLUT-1）染色来定量大脑血管上的葡萄糖转运蛋白数量（血管壁完整性的指标），使用GLUT-1多克隆兔抗GLUT1（1:80 000）。为了评估激活的小胶质细胞（神经炎症的指标），使用多克隆山羊抗IBA1（1:8000，Abcam，Cambridge，United Kingdom）对离子化钙结合接头分子1（IBA-1）进行染色。使用驴抗山羊生物素（1:1500）和驴抗兔生物素（1:1500）作为二级抗体。

在海马（-1.97 mm后于bregma）的三个连续切片中定量DCX阳性细胞。在40倍放大下，由两名独立观察者使用配备MBF Bioscience硬件和软件的Zeiss Axioscop显微镜对染色的大脑区域进行计数。使用ImageJ在用Axio Imager A2（Zeiss Germany）拍摄的切片照片中对GLUT-1和IBA-1阳性（+）DAB-Ni免疫组化进行评分。IBA-1和GLUT-1密度的测量定义为（a）相对IBA-1+或GLUT-1+染色面积，或（b）每mm²的IBA-1+或GLUT-1+染色面积，均在皮层、丘脑和海马（bregma -1.97 mm）中。此外，通过从255中减去平均颗粒强度来计算GLUT-1染色的强度。使用ImageJ在上述相同区域对强度进行定量。

2.15 统计

使用Ingenuity Pathway Analysis套件中的上游调节因子分析工具分析上游调节因子。使用IBM SPSS for Windows 25.0软件（SPSS Inc，Chicago，IL，USA）分析所有其他数据，并以均值±标准误表示。

在多个单独时间点测量的参数（例如，体重、热量摄入以及Morris水迷宫的习得）使用重复测量方差分析，并使用Bonferroni校正进行多次比较。使用事后Dunnett多重比较双侧t检验将治疗组与HFD对照组进行比较。此外，还使用相同的Dunnett事后检验将显著效应与饲料组进行比较。这些结果在表S2中描述。使用事后Dunnett多重比较双侧t检验将治疗组与HFD对照组和饲料对照组进行比较。当存在饮食和时间之间的显著交互作用时，将数据按相关因素拆分，并再次使用重复测量方差分析进行分析。所有其他数据（行为测试、成像、生化）使用多变量方差分析进行分析，并使用Bonferroni校正进行多次比较（正态分布），然后使用Dunnett多重比较双侧t检验，或Kruskal–Wallis检验（非正态分布数据）后跟事后Mann-Whitney U检验将组与HFD和饲料组进行比较。从数据集中移除统计异常值。每个测试中被认为异常值的小鼠数量在表S3中描述。

三、结果

3.1 PA减轻了与食物摄入无关的HFD诱导的肥胖

在16周的导入期间，接受HFD处理的小鼠比接受饲料的参考小鼠体重增加显著更多（P<.001；见图1B）。在12周的治疗后，这些体重增加差异仍然存在，HFD喂养的小鼠比饲料喂养的小鼠显著更重（P<.001）。未观察到CA对体重减轻的影响，而PA显著减轻了HFD诱导的体重增加（与HFD相比P<.05）。平均热量摄入在HFD中略低于饲料（P<.05，表1）。HFD、CA和PA之间的热量摄入没有差异。

3.2 PA减轻了代谢风险因素和收缩压

接下来，我们检查了治疗对代谢风险因素（表1）的影响。HFD增加了血浆胆固醇和甘油三酯浓度（P<.01），而CA或PA均未影响这一结果。所有组的葡萄糖水平相当（表1）。HFD显著增加了胰岛素水平（P<.01）。CA未影响血浆胰岛素水平，而PA降低了HFD诱导的血浆胰岛素水平增加（P<.05）。

通过测量收缩压评估肥胖相关的高血压。在开始CA和PA治疗之前，HFD喂养的小鼠比饲料喂养的小鼠收缩压显著更高（P<.001），并且这种差异持续到实验结束（P<.001）。CA对收缩压没有显著影响，而PA降低了HFD诱导的收缩压增加（P<.01；表1）。

SAA是一种由脂肪组织和肝脏炎症产生的炎症标志物，其在饲料上的水平较低，并且在HFD下显著增加（P<.001）。SAA水平未受CA治疗的影响，而PA治疗倾向于降低HFD诱导的SAA水平增加（P=.056）。

3.3 PA治疗减轻了HFD诱导的肝脏脂肪肝、炎症和胶原含量

接下来，我们研究了肝脏，这是SCFAs从肠道吸收后首先经过的器官。HFD增加了肝脏重量（P<.001，图2A），而CA或PA均未影响肝脏重量。通过苏木精-伊红（HE）染色的肝脏横截面分析NAFLD的组织病理学特征（图2B）。在饲料组中几乎不存在大泡性脂肪肝（图2C），而HFD喂养的小鼠出现了明显的大泡性脂肪肝（P<.001）。CA治疗未影响大泡性脂肪肝。相比之下，PA治疗显著减轻了HFD诱导的大泡性脂肪肝（P<.05）。HFD喂养动物的小泡性脂肪肝（图2D）也增加（P<.001），CA无影响，而PA有降低趋势（P=.08）。异常增大的肝细胞（肝细胞肥大；图2E）所占的横截面积在HFD下显著增加（P<.05），而这种HFD诱导的增加仅被PA显著减轻（P<.05）。炎症聚集在饲料上几乎不存在（图2F），而HFD肝脏显示出高数量的炎症聚集（P<.001）。CA未显著影响炎症聚集的数量。然而，PA减少了HFD诱导的炎症聚集数量（P<.01）。

图2. CA和PA治疗12周对肝脏的影响。A，肝脏重量，（B）代表性苏木精-伊红染色肝脏切片图像，（C）大泡性脂肪肝，（D）小泡性脂肪肝，（E）肝细胞肥大和（F）肝脏炎症。分析肝脏匀浆中的G）胶原含量，（H）胆固醇酯（CE）、甘油三酯（TG）和游离胆固醇（FC），（I）酮体β-羟基丁酸作为β-氧化速率的标志以及（J）糖原。HFD：高脂饮食；PA：丙酸；CA：己酸。数据以均值±标准误表示，*P<.05 或 **P<.01 或 ***P<.001 与HFD相比

以胶原含量作为纤维化的衡量标准来测定肝脏胶原含量（图2G）。HFD显著增加了肝脏胶原含量（P<.01）。肝纤维化未受CA影响，而PA降低了肝脏胶原含量（P<.01）。

通过测量肝脏脂质、β-羟基丁酸和肝脏匀浆中的糖原补充组织病理学分析。胆固醇酯（CE）、甘油三酯（TG）和游离胆固醇（FC）的肝脏脂质分析显示，CE和TG在HFD下显著增加（CE和TG：P<.001；图2H）。CA未改变任何肝脏脂质，而PA降低了HFD诱导的CE水平（P<.05）。β-羟基丁酸是一种在脂质β-氧化过程中形成的酮体，其浓度未受CA和PA的影响（图2I）。由于脂肪肝和胰岛素抵抗与糖原合成受损相关，我们定量了肝脏糖原水平（图2J）。与饲料相比，HFD降低了糖原水平（P<.001）。CA（P<.01）和PA治疗（P<.05）部分预防了HFD诱导的糖原水平降低。

总之，这些数据表明CA对肝脏病理学没有影响，而PA减轻肥胖和代谢风险因素的效果与NASH和纤维化的显著减少相呼应。

3.4 PA减少了皮下脂肪质量并增加了小脂肪细胞的频率

接下来，我们确定PA减轻体重的观察结果是否伴随着对不同脂肪库的脂肪量、脂肪细胞形态和炎症的影响（图3）。sWAT、gWAT和mWAT的质量在HFD处理下增加（与饲料相比P<.001，图3A-C）。CA未影响这些库的质量，而PA显著减少了WAT质量（与HFD相比P<.05），并且非显著性降低了mWAT质量（与HFD相比P=.08）。

图3. CA和PA治疗12周后皮下（sWAT）、附睾（gWAT）和肠系膜（mWAT）脂肪库的脂肪组织分析：（A）sWAT，（B）gWAT，和（C）mWAT重量。脂肪细胞大小分布在（D）sWAT，（E）gWAT，和（F）mWAT中。每1000个脂肪细胞中的冠状结构（CLS）数量在（G）sWAT，（H）gWAT，和（I）mWAT中。HFD：高脂饮食；PA：丙酸；CA：己酸。数据以均值±标准误表示，*P<.05 或 **P<.01 或 ***P<.001 与HFD对照组相比

与饲料相比，HFD喂养导致所有三个库中脂肪细胞肥大频率增加（>8000 µm²的脂肪细胞百分比：sWAT中P<.001；gWAT中P<.01；mWAT中P<.001；图3D-F），同时小脂肪细胞（<2000 µm²的脂肪细胞百分比）数量减少（sWAT中P<.001；mWAT中P<.05；eWAT中P<.01；图3D-F）。只有PA能够影响这些HFD诱导的变化，在sWAT中小脂肪细胞（2000-4000 µm²）的频率增加（P<.05），而在mWAT中肥大脂肪细胞（>8000 µm²）的频率减少（P<.05）。WAT炎症，通过冠状结构（CLS）数量量化，在饲料上几乎不存在（图3G-I）。与饲料相比，HFD喂养增加了gWAT（P<.001）和mWAT（P<.05）中的CLS数量。CA和PA治疗相对于HFD未影响这些库中的CLS计数。

综上所述，PA对sWAT中的脂肪量有适度影响，但未减少sWAT、gWAT或mWAT中的WAT炎症。

3.5 CA和PA不影响行为或空间记忆

使用旋转杆研究运动协调。在干预开始前，HFD喂养的小鼠比饲料喂养的小鼠跌落潜伏期更短（P<.001；图S1A）。在实验结束时，HFD仍然比饲料小鼠更早从杆上跌落（P<.001），并且这一结果未受CA或PA的影响（图4A）。

图4. 行为和认知测试。A，从旋转杆上跌落的潜伏期。B，在旷场测试中在角落、周边和中心花费的累积时间（秒）。C，Morris水迷宫（MWM）的习得测试，治疗前后。测量找到平台的潜伏期，连续进行4天。D，平均游泳速度，（E）穿过原平台位置的频率，以及（F）在原平台位置花费的总时间。HFD：高脂饮食；PA：丙酸；CA：己酸。数据以均值±标准误表示，*P<.05。旷场测试：每组N=14（饲料和HFD）或N=15（CA和PA）。MWM和旋转杆测试：每组N=14（HFD）或N=15（饲料，CA，PA）只小鼠

我们未发现在干预开始前（图S1B）以及实验结束时（图4B）旷场实验中的探索或运动活动存在差异。然而，与饲料小鼠相比，PA小鼠在旷场的周边花费的时间更少，而在角落花费的时间更多（P<.05；图4B），而进入角落的频率在各组之间没有差异。这表明PA小鼠的焦虑情绪增加。此外，与饲料小鼠相比，PA小鼠的步行速度降低，总移动距离减少（图S1C，D；表S2），尽管在干预开始前和实验结束时通过DVC监测的白天或夜间的家庭笼活动未观察到组间差异（图S2A，B）。

使用Morris水迷宫测试小鼠的空间学习和记忆。在干预开始前，所有小鼠在习得阶段的第1-2天、第1-3天和第1-4天之间均显示出显著的学习效果（P<.001；图4C）。在治疗10周后重复进行Morris水迷宫测试时，我们同样发现小鼠仍然能够在25-54秒内找到隐藏的平台，并且各治疗组之间没有差异。接下来，进行探测试验，移除了Morris水迷宫的平台。在干预开始时（图S1E-G）以及实验结束时，在平均游泳速度、访问原平台位置的频率或在原平台位置花费的时间方面，各治疗组之间未观察到显著差异（图5D-F）。

图5. 脑血管参数。A，在正常条件下评估的脑血流（CBF）水平；以及（B）在血管收缩条件下在皮层、海马和丘脑中的CBF。C，使用正常和血管收缩CBF测量脑血管反应性，作为对血管收缩刺激的反应能力的衡量标准（D）代表性GLUT-1染色图像，显示Chow、HFD、CA和PA小鼠（5×物镜，比例尺代表500 µm）。E，量化相对GLUT-1+面积，以及（F）皮层、海马和丘脑中每mm²的GLUT-1+颗粒数量。HFD：高脂饮食；PA：丙酸；CA：己酸；CBF：脑血流；GLUT-1：葡萄糖转运蛋白1。数据以均值±标准误表示，*P<.05 或 **P<.01 或 #P<.08。CBF：每组N=14（饲料和CA），N=13（HFD）和N=15（PA）。GLUT-1：每组N=14（HFD），N=14（饲料，CA）或N=15（PA）只小鼠

总之，这些行为实验表明CA和PA未能逆转HFD诱导的旋转杆测试中运动协调能力的降低。探索活动以及空间学习和记忆未受HFD喂养的影响，并且未受CA和PA治疗的影响。

3.6 PA治疗逆转了HFD诱导的脑血管反应性变化

通过在正常和血管收缩条件下测量大脑皮层、丘脑和海马的脑血流（CBF），来评估对脑血管的影响。然后使用这两个参数来计算脑血管反应性，即对血管收缩刺激的反应能力。在任何评估区域，各组之间的正常和血管收缩条件下的CBF均无差异（图5A，B）。虽然HFD（与饲料相比）和CA（与HFD相比）对脑血管反应性没有影响，但PA显著改善了大脑皮层和海马的脑血管反应性（与HFD相比P<.05；图5C），并将脑血管反应性恢复到饲料水平（与饲料相比P>.05）。

进行免疫组化染色以评估神经发生（DCX）、神经炎症（IBA-1）和脑血管完整性（GLUT-1）。在海马中DCX+细胞的数量在各组之间未观察到差异（图S3A）。此外，在皮层、海马或丘脑中IBA-1+染色量或相对IBA-1+阳性面积在各组之间未观察到差异（图S3B，C）。与饲料喂养的小鼠相比，HFD喂养的小鼠在丘脑中的相对GLUT-1+面积更小（P<.05；图5D）。CA未产生影响，而PA增加了GLUT-1+面积（P<.05）和每mm²的GLUT-1+颗粒数量，这是血管密度的衡量标准，在海马中（P<.05；图5D，E）。每mm²的GLUT-1+颗粒数量甚至高于饲料小鼠（P<.05）。GLUT-1强度，反映了GLUT-1转运蛋白的数量，在饲料（与饲料相比）或CA（与HFD相比）中未受影响。然而，我们观察到PA小鼠中GLUT-1强度有增加趋势，与HFD相比在皮层（P=.056）和海马（P=.079）中。PA小鼠中的GLUT-1强度甚至高于饲料小鼠，在海马中（P<.05；图S3D）。

总之，PA将海马和皮层的脑血管活性降低到饲料水平，并增加了每mm²的GLUT-1+颗粒数量，反映了血管密度，以及海马中GLUT-1强度，这是GLUT-1转运蛋白数量的指标。

3.7 PA逆转了HFD诱导的功能连接和微观结构灰质和白质完整性的变化

为了深入了解HFD诱导的肥胖对大脑功能和微观结构变化的影响以及CA和PA的影响，进行了线粒体酶活性分析、rs-fMRI和DTI。

小脑线粒体CS酶活性在各组之间相当，且复合体（I-IV）的活性未受治疗影响（图S4）。

通过总相关和部分相关分析使用rs-fMRI评估功能连接。在这里，我们未观察到使用总相关分析的功能连接存在差异（图S5）。部分相关突出了两个区域之间的直接连接。与饲料小鼠相比，HFD小鼠在视觉皮层和听觉皮层之间的部分功能连接减少（P<.001；图6A，B）。CA和PA与HFD相比对功能连接没有影响。然而，CA和PA小鼠的功能连接与饲料小鼠相当（P>.05），表明CA和PA能够逆转HFD诱导的功能连接变化。

图6. 脑区之间的功能连接以及白质完整性。A，饲料、HFD、CA和PA实验组的部分相关矩阵。所选脑区（背侧海马（DH）、腹侧海马（VH）、听觉皮层（AC）、运动皮层（MC）、体感皮层（SSC）和视觉皮层（VC））分为左半球（第一行）和右半球（第二行）。较高的Z分数（红色）表示更强的功能连接。B，HFD与饲料、CA与HFD以及PA与HFD之间的功能连接的统计分析。矩阵中的减号（−）表示连接性降低。橙色：P<.05）。C，各实验组之间在海马、运动皮层、体感皮层和视觉皮层中的分数各向异性差异，以及（D）平均扩散率。数据以均值±标准误表示，*P<.05，**P<.01。每组N=14（HFD）或N=15（饲料，CA，PA）只小鼠

接下来，使用DTI评估几个大脑区域的灰质和白质完整性。HFD小鼠的FA在体感皮层（P<.05）和视觉皮层（P<.05）中高于饲料喂养的小鼠。未观察到CA或PA对这些大脑区域中HFD诱导的FA水平增加的影响。然而，PA小鼠的FA水平与饲料相当（P>.05），表明PA逆转了HFD在体感皮层和视觉皮层诱导的效应。此外，HFD和CA对海马和运动皮层的FA没有影响，但PA处理的小鼠在海马（P<.01）和运动皮层（P<.05）中的FA显著低于HFD小鼠。PA小鼠在这些区域的FA与饲料相当（两个区域P>.05）。

在海马、运动皮层、体感皮层和视觉皮层中的MD未受HFD（与饲料相比）、CA和PA（与HFD相比）的影响（图6D）。HFD喂养动物的视神经中的MD显著低于饲料喂养动物（P<.001，图6D）。CA和PA相对于HFD在任何评估区域均未影响MD。然而，PA喂养小鼠与饲料小鼠在视神经中的MD没有差异（P>.05），表明PA逆转了HFD在该区域诱导的MD效应。

综上所述，CA和PA能够逆转HFD诱导的视觉皮层和听觉皮层之间功能连接的变化。PA改变了海马和运动皮层的微观结构灰质完整性，但与饲料相比并不显著。此外，PA逆转了HFD在体感皮层、视觉皮层和视神经中诱导的效应。

3.8 PA影响突触发生和炎症的基因和上游调节因子

使用qRT-PCR和多路神经炎症小组研究海马中的基因表达。突触后密度标记物Psd95 mRNA水平在各实验组之间没有差异（图7A）。同样，在饲料、HFD和CA小鼠之间未观察到突触素（Syp1）mRNA水平的差异。在PA处理的小鼠中观察到海马中突触素表达降低的趋势（与HFD相比P=.055；图7B），然而，与饲料相比并不显著。

图7. 海马中突触后密度、突触素和上游调节因子。A，海马中突触后密度-95和（B）突触素mRNA表达水平。每组N=14（HFD）或N=15（饲料，CA，PA）只小鼠。C，从转录因子或关键调节因子的变化中预测上游调节因子的变化，用Z分数表示。Z<-2表示相关抑制（以绿色显示），Z>2表示相关激活。Z<-1.96的显著变化以浅绿色显示。N/A表示与上游调节因子相关联的差异表达基因数量不足。P值表示调节因子下游基因的显著富集。每组N=8。数据以均值±标准误表示

使用神经炎症小组进行更广泛的基因分析，随后进行上游调节因子分析和生物通路富集分析，证实了这一效应。饲料和HFD之间、HFD和CA之间预测的上游调节因子的激活状态没有显著变化（图7C；IFNG和STAT1下游的信号通路在HFD中显著富集，但未达到相关抑制或激活的截止值）。PA相对于HFD抑制了突触发生中重要的特定上游调节因子（例如，GH1、WNT3A、VEGFA、BDNF、EGF、JUN；见图7C）。PA还减弱了N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体的信号传导，NMDA受体是一种突触后谷氨酸受体，参与兴奋性神经传递，对突触可塑性和记忆功能至关重要。此外，PA抑制了例如IL-1、IL-1B、IL17A、Il-33、CXCL12等下游的炎症通路。上述发现得到了典型通路分析的支持，显示PA显著抑制了突触发生和谷氨酸受体信号传导、神经炎症和脂多糖（LPS）刺激的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号传导通路（所有P<.05）。

总之，我们发现PA治疗显示出抗炎效应，并减少了突触发生和突触可塑性信号传导。

四、讨论

本研究检查了PA和CA治疗对肥胖诱导的肝纤维化以及大脑功能和结构的潜在健康影响。据我们所知，此类影响尚未被研究过，并且在饮食诱导的肥胖、代谢紊乱和炎症的啮齿动物模型中，尚未发表过关于CA的研究。

在本研究中，CA治疗对体重、血浆脂质和代谢风险因素以及肝脏脂肪肝均无显著影响。有趣的是，HFD治疗显著降低了肝脏糖原含量，而CA和PA均显著预防了这种降低，表明CA和PA对肝脏代谢有影响。肝脏糖原含量降低似乎表明肝脏代谢存在缺陷、肝脏功能受损和肝脏胰岛素抵抗，如其他研究人员所报告的那样，这种效应在HFD喂养的Ldlr−/−.Leiden NASH模型中尚未被报道。由于肝脏糖原含量通常不在NAFLD/NASH的啮齿动物研究中测定，因此尚不清楚这两个效应是否相互关联。众所周知，慢性组织炎症可以损害胰岛素信号传导，从而对肝脏胰岛素抵抗做出贡献。因此，观察到的肝脏糖原增加（需要胰岛素信号传导才能形成）可能是CA可能的抗炎效应的次要结果。

与CA相比，PA治疗独立于食物摄入预防了进一步的HFD诱导的体重增加。这里观察到的对体重减轻以及血浆胰岛素水平的降低与Lin等人的研究一致，该研究使用了类似的2.2% w/w PA剂量。此外，我们观察到HFD增加了收缩压，这一发现与早期研究一致。PA治疗能够降低HFD诱导的收缩压增加，这与另外两项小鼠模型中的观察结果一致，并且可能归因于PA诱导的内皮依赖性血管舒张，如之前在尾动脉中所报道的那样。由于高收缩压与高体重以及人类认知能力下降相关，PA对收缩压和体重的影响可能会降低认知能力下降的风险。

PA治疗对肥胖和代谢风险因素的减轻效应与肝脏脂肪肝的减少相关，伴随着肝脏胆固醇酯含量的减少。这些发现与之前的研究一致，该研究显示NAFLD患者（通过磁共振成像评估）在结肠PA水平增加时肝脏内脂质积累减少，以及体外和体内研究表明PA抑制脂质合成。PA的抗脂肪肝效应的另一种解释可能是PA刺激β-氧化，如之前在短期小鼠研究中所报道的那样。然而，我们未观察到PA对肝脏β-羟基丁酸的影响，这是β-氧化的标志，表明这一途径在本研究中并非主要。与研究人员的发现之间的差异可能是由于小鼠品系和饮食的差异、本研究中使用的较低PA剂量（2.5% w/w）、这里使用的治疗设置或测量β-氧化的方法差异。

PA还对肝脏炎症聚集和胶原含量显示出显著的效应，表明PA可以减少NASH和肝纤维化的发展。据我们所知，我们是第一个全面研究PA对肝脏脂肪肝、炎症和纤维化的影响的研究。之前已有研究报道PA对其他器官和病理的抗炎效应，例如急性白血病、心血管疾病和炎症性肠病，尽管其潜在机制尚不清楚。

为了评估PA和CA对行为和认知的影响，我们进行了行为和认知测试。我们发现HFD喂养的小鼠在旋转杆测试中运动协调能力降低。CA和PA未能逆转这一效应。与饲料小鼠相比，PA小鼠在旷场测试中角落花费的时间更多，表明PA小鼠比饲料喂养的小鼠更焦虑。其他研究也报告了PA给药后焦虑样行为增加。探索活动以及空间学习和记忆未受HFD、CA或PA的影响。其他研究发现，通过脑室内注射相对高剂量（4 µL的0.26 M）PA的大鼠存在认知缺陷、增加的运动活动和空间记忆受损。

我们测量了脑血管反应性，即对血管收缩刺激的反应能力，以研究PA和CA对脑血管健康的影响。总体而言，我们检测到的脑血管反应性水平与另一项研究中发现的相似。与饲料相比，HFD小鼠的皮层和海马的脑血管反应性水平非常低，尽管尚未达到显著性（皮层：P=.089；海马：P=.100）。HFD诱导的肥胖与脑血管重塑相关，这是一种血管壁的结构变化的主动过程。这些血管的结构变化可能导致血管直径减小，并导致对血管收缩刺激的过度反应。高血压可以诱导（大脑）组织的高灌注，随后导致血管重塑。此外，高血压和肥胖与血管稀少（毛细血管和小动脉的丢失）相关，这进一步促成了血管重塑。与之相符的是，与饲料相比，HFD小鼠的丘脑中相对GLUT-1+面积减少。GLUT-1选择性表达在大脑毛细血管内皮细胞中，被用作脑血管完整性的标志。这表明HFD能够影响脑血管完整性。

PA逆转了HFD诱导的海马和皮层脑血管活性的变化，恢复到饲料水平。这种适应性脑血管反应性与海马中GLUT-1的增加一致，可能解释了PA对脑血流动力学的影响。总之，这表明PA能够逆转HFD诱导的血管重塑。

我们揭示了PA主要逆转了HFD在视觉系统不同组成部分中的诱导效应，即视觉皮层和视神经。HFD降低了视觉皮层和听觉皮层之间的功能连接，这一效应被CA和PA逆转。此外，与饲料小鼠相比，HFD小鼠在皮层区域（即视觉和体感皮层）的FA更高，而在视神经中的MD更低。PA处理降低了视觉和体感皮层的FA，并增加了视神经中的MD，这可能表明PA逆转了HFD诱导的变化或在PA治疗开始时预防了进一步的变化。Medic等和Ou等的近期研究表明，白质完整性与增加的肥胖度呈正相关。此外，我们在海马中发现了PA对突触发生可能产生的负面影响。海马中的基因表达分析显示，突触信号传导减少，并与谷氨酸信号传导和上游调节因子NMDA的减少相关。神经元谷氨酸信号传导对于信息编码、记忆的形成和提取、空间识别以及意识的维持至关重要。NMDA受体参与髓鞘形成过程，与之相符的是，NMDA受体拮抗剂（如美金刚和MK801）已在大鼠的海马中显示出FA减少。

总之，我们发现PA对代谢风险因素产生了显著的积极效应，并减轻了HFD诱导的NASH和肝纤维化的发展。PA还降低了收缩压并逆转了脑血管反应性。PA逆转了HFD诱导的功能连接和微观结构灰质和白质完整性的变化，恢复到饲料水平。然而，PA也增加了焦虑样行为，并减少了海马中突触发生的调节。因此，尽管观察到了对代谢、（脑）血管以及大脑结构和功能的积极效应，但在考虑将PA作为治疗手段时应谨慎使用。

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